Microscopios y detectores#
Outline del capítulo
La elección del microscopio influye en el desenfoque, el ruido y la resolución temporal de las imágenes.
Un detector ideal tendría una alta eficiencia cuántica y un bajo ruido de lectura
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%load_ext autoreload
%autoreload 2
# Default imports
import sys
sys.path.append('../../../')
from helpers import *
from matplotlib import pyplot as plt
from myst_nb import glue
import numpy as np
from scipy import ndimage
Introducción#
Para analizar con éxito una imagen es necesario, en primer lugar, que contenga realmente la información necesaria. Hay varias cuestiones prácticas relacionadas con la biología (por ejemplo, no interferir demasiado con los procesos, por ejemplo matando cosas sin querer) y el manejo de datos (profundidad de bits, formatos de archivos, cualquier otra cosa en la Parte I de este libro). Sin embargo, suponiendo que estén en orden, hay otros tres factores principales a considerar relacionados con el contenido de la imagen:
Información espacial, dependiendo del tamaño y forma del PSF,
Ruido, dependiendo del número de fotones detectados,
Resolución temporal, dependiendo de la velocidad a la que el microscopio puede grabar imágenes.
Actualmente, ningún tipo de microscopio es capaz de optimizarlos todos simultáneamente, por lo que es necesario tomar decisiones y hacer concesiones. La resolución temporal y el ruido tienen una relación obvia: una resolución temporal alta significa que se dedica menos tiempo a detectar fotones en la imagen, lo que genera más ruido de fotones. Sin embargo, la mejora de la información espacial también suele estar relacionada con uno o ambos de los otros dos factores.
Este capítulo ofrece una descripción muy breve de las características principales de varios microscopios de fluorescencia desde el punto de vista de cómo equilibran las ventajas y desventajas mencionadas.
Advertencia
¡Esta discusión no le hace justicia a todas las complejidades, variaciones y características de los microscopios que describe!
De ninguna manera soy un experto en microscopía: solo analizo los datos. Pero este capítulo intenta resumir las principales cosas que aprendí y que son relevantes para el análisis mientras trabajaba en un centro de imágenes. Está un poco anticuado, pero lo he conservado de todos modos por si a alguien le puede resultar útil como punto de partida.
Para obtener una descripción más extensa y autorizada de los temas considerados aquí, considere buscar el Handbook of Biological Confocal Microscopy editado por James Pawley. Contiene muchos capítulos excelentes, algunos de los cuales pueden estar disponibles para descargar desde el sitio web del editor.
Tipos de microscopio#
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fig = create_figure(figsize=(8, 4))
show_image('images/excite_widefield.png', title='Widefield', pos=151)
show_image('images/excite_confocal.png', title='LSCM', pos=152)
show_image('images/excite_spinning_disc.png', title='SDCM', pos=153)
show_image('images/excite_2p.png', title='2-Photon', pos=154)
show_image('images/excite_tirf.png', title='TIRF', pos=155)
glue_fig('fig_microscopes_types', fig)
Figura 155 Diagramas esquemáticos para mostrar las diferencias en los patrones de excitación. Aquí se supone un microscopio invertido (la célula descansa sobre un cubreobjetos y se ilumina desde abajo). Durante la grabación de un píxel, se puede detectar luz si surge de cualquier parte de la región iluminada en verde, aunque en el caso de confocales de escaneo láser y disco giratorio el pinhole solo permitirá que pase una fracción de esta luz. Ten en cuenta que, para el microscopio de 2 fotones, la excitación se limita sólo a la pequeña región central, mientras que la luz roja arriba y abajo no es capaz de excitar los fluoróforos que se han utilizado.#
Campo amplio#
Hasta ahora, nuestros diagramas esquemáticos y discusión sobre PSF se han concentrado en microscopios de campo amplio. En la microscopía de campo amplio, toda la muestra está bañada en luz, de modo que muchos fluoróforos de toda la muestra pueden excitarse y emitir fotones simultáneamente. Luego, toda la luz que ingresa al objetivo puede detectarse y contribuir a la grabación de cualquier imagen. Debido a que los fotones se emiten potencialmente desde todas partes de la muestra, habrá mucho desenfoque en una muestra gruesa (en una muestra delgada no hay mucha luz procedente de planos desenfocados porque los planos simplemente no contienen nada que pueda ser fluorescente).
Lo que obtenemos en cualquier imagen grabada es efectivamente la suma de la luz del plano enfocado y de todos los demás planos desenfocados. Visto en términos de PSF, capturamos parte de la forma de reloj de arena producida por cada punto emisor de luz dependiendo de qué tan enfocado esté en cada imagen.
Esto es una mala noticia para la información espacial y también para la detección de estructuras pequeñas en muestras gruesas, porque la luz desenfocada es esencialmente un fondo inútil. Por otro lado, las imágenes de campo amplio tienden a incluir muchos fotones, lo que supera el ruido de lectura, incluso cuando se graban rápidamente.
Confocal de escaneo láser#
El seccionamiento óptico es la capacidad de detectar fotones solo desde el plano de enfoque, rechazando los de otros lugares. Esto es necesario para observar muestras gruesas sin perderse en la bruma de otros planos. La microscopía confocal de barrido láser (LSCM) logra esto concentrándose solo en detectar la luz de un píxel en cualquier momento y usando un pinhole para tratar de permitir que solo se detecte la luz de un punto correspondiente en la muestra.
Debido a que como máximo sólo se registra un píxel en un momento dado, no tiene sentido iluminar toda la muestra a la vez, lo que podría causar daños innecesarios. Más bien, un láser ilumina sólo un pequeño volumen. Si esto fuera lo suficientemente pequeño, entonces no sería necesario un pinhole porque sabríamos que toda la luz emitida debe provenir del punto iluminado; sin embargo, la iluminación en sí es como un PSF de reloj de arena en la muestra. El pinhole es necesario para que solo llegue al detector la luz de la parte central. Esto hace que el PSF final, tal como aparece en la imagen, adopte una apariencia más parecida a una pelota de rugby (o fútbol americano).
El resultado final es una imagen que tiene relativamente poca luz desenfocada. En comparación con la microscopía de campo amplio, LSCM proporciona una mejora significativa en lo que se puede ver a lo largo de la dimensión z, aunque la resolución xy no es muy diferente. Además, debido a que los píxeles individuales se graban por separado, la imagen puede (potencialmente) tener más o menos cualquier tamaño y forma, en lugar de estar limitada por el recuento de píxeles de una cámara.
Sin embargo, estas ventajas conllevan un gran inconveniente. Las imágenes normalmente contienen miles o millones de píxeles, por lo que sólo una pequeña fracción del tiempo necesario para grabar una imagen se dedica a detectar fotones para cualquier píxel en una imagen LSCM, a diferencia del caso de campo amplio, donde los fotones se pueden detectar para todos los píxeles durante todo el tiempo de adquisición de la imagen. Esto puede hacer que la adquisición de imágenes LSCM sea comparativamente lenta, ruidosa (en términos de pocos fotones detectados) o ambas cosas. Por lo tanto, la información espacial se obtiene a un costo de ruido y/o resolución temporal.
¿Por qué a menudo se recomienda configurar el pinhole en LSCM para que tenga el mismo tamaño que un disco Airy? ¿Y por qué a veces es mejor no seguir estrictamente esta recomendación?
Como se describe en Desenfoque y Función de dispersión de punto (Point Spread Function o PSF por sus siglas en inglés), la gran mayoría de la luz del plano enfocado cae dentro del disco de Airy. El uso de un pinhole más pequeño que este puede provocar que se detecte tan poca luz que la imagen se vuelva demasiado ruidosa para ser útil. Por otro lado, aumentar el tamaño del pinhole dará como resultado algo más de luz restante ubicada en los anillos exteriores del patrón de Airy, pero la mayoría de los fotones adicionales provendrán de planos desenfocados. Esto provoca una reducción de la eficacia del seccionamiento óptico. Por lo tanto, un diámetro de pinhole de aproximadamente 1 disco de Airy proporciona un equilibrio razonable entre detectar la mayor parte de la luz enfocada y lograr un buen seccionamiento óptico.
Sin embargo, a veces una reducción en el seccionamiento óptico es un costo que vale la pena, como cuando los fotones son muy escasos y es tolerable algo de fondo adicional. Además, al grabar una imagen multicanal, es posible que tengas que configurar el tamaño del orificio de acuerdo con el disco Airy para un canal. Pero debido a que el tamaño del disco depende de la longitud de onda de la luz (como se describe en la Ecuación (1)), el diámetro del pinhole diferirá en términos de tamaños de disco de Airy para otros canales.
Confocal de disco giratorio#
Por lo tanto, un sistema de campo amplio registra todos los píxeles a la vez sin impedir que la luz llegue al detector en ninguna parte, mientras que un LSCM puede bloquear la luz desenfocada grabando solo un píxel a la vez. Ambas opciones parecen extremas: ¿no podría haber un compromiso?
La microscopía confocal de disco giratorio (SDCM) implementa uno de esos compromisos mediante el uso de una gran cantidad de pinholes perforados en un disco, de modo que los fluoróforos puedan excitarse y detectarse la luz para muchos píxeles diferentes no adyacentes simultáneamente. Al no intentar grabar píxeles adyacentes al mismo tiempo, se pueden utilizar pinholes para bloquear la mayor parte de la luz desenfocada de cada píxel, ya que se origina cerca de la región de interés de ese píxel (es decir, el PSF se vuelve muy tenue en ubicaciones alejadas de su centro), pero los píxeles suficientemente espaciados aún se pueden grabar simultáneamente con poca influencia entre sí.
En la práctica, es probable que las imágenes de microscopía confocal de disco giratorio sean menos nítidas que las imágenes confocales de escaneo láser porque parte de la luz se dispersa a través de otros pinholes. Además, los tamaños de los pinholes no se pueden ajustar para ajustar el equilibrio entre el ruido y el seccionamiento óptico. Sin embargo, el seccionamiento óptico que ofrece SDCM es al menos una mejora considerable con respecto al caso de campo amplio, y se puede lograr una SNR aceptable con velocidades de cuadros mucho más rápidas usando SDCM en lugar de LSCM.
Microscopía multifotónica#
Como se mencionó anteriormente, si el tamaño del volumen de excitación pudiera reducirse lo suficiente, entonces sabríamos dónde se originaron los fotones incluso sin que se requiera un pinhole. Pero la excitación enfocada generalmente todavía está sujeta a problemas relacionados con la PSF, por lo que los fluoróforos en todo un volumen en forma de reloj de arena pueden terminar excitandose. La idea principal de la microscopía multifotónica es que la excitación del fluoróforo requiere la absorción simultánea de múltiples fotones, en lugar de un solo fotón. La luz de excitación tiene una longitud de onda más larga que la que de otro modo sería necesaria para provocar la excitación molecular con un solo fotón, pero las energías de los múltiples fotones se combinan para provocar la excitación.
El beneficio de esto es que la excitación multifotónica solo ocurre en la región focal de la excitación; en otras partes dentro del “PSF de muestra” las intensidades de la luz son insuficientes para producir el “efecto multifotónico” y elevar los fluoróforos a un estado excitado. Esto significa que la región de la muestra que emite fotones en un momento dado es mucho más pequeña que cuando se utiliza la excitación de un solo fotón (como en LSCM), y también se causa menos daño a la muestra fuera del plano de muestra. Además, la microscopía multifotónica es capaz de penetrar más profundamente en una muestra, hasta varios cientos de µm.
Fluorescencia de reflexión interna total#
Como se mencionó anteriormente, las imágenes de campo amplio de especímenes muy delgados no sufren mucho desenfoque porque la luz no se emite desde muchos otros planos. La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) hace uso de esto estimulando la fluorescencia solo en una sección muy delgada de la muestra cerca del objetivo. Muy brevemente, la microscopía TIRF implica el uso de una iluminación en ángulo de modo que el cambio en el índice de refracción encontrado por la luz cuando se acerca a la muestra provoque un cambio adicional en el ángulo suficiente para evitar que la luz entre directamente en la muestra (es decir, se refleja totalmente internamente). Sin embargo, los fluoróforos aún pueden excitarse mediante una onda evanescente que se produce cuando esto ocurre. Esta onda decae exponencialmente, de modo que sólo se excitan los fluoróforos que se encuentran justo en la superficie, lo que significa que los fluoróforos más profundos dentro de la muestra no interfieren con la grabación.
Es importante destacar que, debido a que la grabación posterior es esencialmente similar a la utilizada cuando se graban imágenes de campo amplio, los fotones se detectan en todos los píxeles en paralelo y son posibles velocidades de grabación rápidas. Por lo tanto, si sólo es necesario ver a una profundidad de unos 100 nm, la microscopía TIRF puede ser una buena opción.
Detectores de fotones#
Ciertos detectores están asociados con ciertos tipos de microscopía y difieren según el nivel y el tipo de ruido que puedes esperar. Comprender los principios básicos es de gran ayuda a la hora de elegir valores sensatos para parámetros como la ganancia, el tamaño de píxel y la agrupación durante la adquisición para optimizar la información útil de la imagen. A continuación se proporciona una introducción muy breve a dos detectores comunes y una variación adicional.
PMT: un píxel a la vez#
Si solo necesitas grabar un píxel a la vez, un tubo fotomultiplicador (PMT) podría ser lo que necesitas. El principio básico es el siguiente: un fotón choca contra un fotocátodo y, con suerte, produce un electrón. Cuando esto ocurre, el electrón se acelera hacia un dínodo y los electrones producidos se aceleran hacia más dinodos. Ajustando la «ganancia», se puede variar la aceleración de los electrones hacia sucesivos dinodos; Aceleraciones más altas significan que hay una mayor probabilidad de que la colisión de los electrones con el dínodo produzca una mayor cantidad de electrones que pasan a la siguiente etapa. La carga de los electrones se cuantifica al final (Figura 156). Debido a que el número (posiblemente muy pequeño) de fotones originales detectados ahora se ha amplificado a un número (posiblemente mucho) mayor de electrones mediante las sucesivas colisiones con dinodos, el efecto del ruido de lectura suele ser menor para un PMT.
Figura 156 Diagrama que muestra la detección de un fotón por un PMT. Cada fotón puede «multiplicarse» para producir muchos electrones acelerando el primer electrón producido hacia un dínodo y repitiendo el proceso para todos los electrones producidos a lo largo de una sucesión de dínodos. La carga de los electrones que llegan al final del proceso se puede entonces cuantificar y debería ser proporcional al número de fotones que llegaron al PMT.#
Lo que es más problemático es que los PMT pueden sufrir el problema de tener una baja Eficiencia Cuántica (QE). El QE es una medida de la proporción de fotones que golpean el detector y que luego producen electrones, y los valores para un PMT convencional pueden ser tan bajos como 10-15%: la mayoría de los fotones que llegan al PMT simplemente se desperdician. Por lo tanto, el ruido de los fotones puede ser un problema importante, especialmente si, en primer lugar, hay poca cantidad de luz disponible para detectar.
Convertir electrones en píxeles
Es importante tener en cuenta que los valores finales de los píxeles no son iguales a la cantidad de fotones detectados, ni siquiera a la cantidad de electrones contados. Son bastante proporcionales, a menudo con una compensación añadida.
Es esencial estimar este desplazamiento (tal vez a partir de una región de fondo o una imagen adquirida sin usar luz de excitación) y restarlo si necesitas comparar valores de píxeles en diferentes imágenes, además de usar configuraciones de adquisición idénticas.
CCD: imágenes rápidas cuando hay muchos fotones#
Un Dispositivo de carga acoplada (CCD) es un detector con una región dedicada a detectar fotones y que se subdivide en diferentes «píxeles físicos» que corresponden a los píxeles de la imagen final. Por lo tanto, el tamaño de la imagen no se puede cambiar arbitrariamente, pero es posible registrar fotones para muchos píxeles en paralelo.
Cuando un fotón golpea un píxel en la parte sensora del CCD, esto a menudo libera un electrón; el QE suele ser alto (quizás 90%). Después de un cierto tiempo de exposición, en cada píxel físico del sensor se forman diferentes «nubes de electrones», cada una de las cuales tiene una carga relacionada con el número de fotones en colisión. Luego, esta carga se mide pasando los electrones a través de un amplificador de carga y los resultados se utilizan para asignar un valor de intensidad al píxel en la imagen final (Figura 157) .
Show code cell content
fig = create_figure(figsize=(8, 4))
show_image('images/ccd_1.png', title='Photon detection', pos=131)
show_image('images/ccd_2.png', title='Frame transfer', pos=132)
show_image('images/ccd_3.png', title='Quantification', pos=133)
glue_fig('fig_microscopes_ccd', fig)
Figura 157 Una ilustración del funcionamiento básico de una cámara CCD (mediante transferencia de fotogramas). En primer lugar, los fotones inciden en un registro sensorial, que se divide en píxeles. Esto hace que se liberen pequeñas nubes de electrones que se acumulan detrás de los píxeles (A). Luego, estos se desplazan rápidamente hacia abajo a otro registro del mismo tamaño, liberando así el registro sensorial para continuar detectando fotones (B). Luego, las nubes de electrones se desplazan hacia abajo nuevamente, una fila a la vez, y cada fila finalmente se desplaza secuencialmente a través de un amplificador de carga (C). Esto cuantifica la carga de las nubes de electrones, a partir de las cuales se determinan los valores de píxeles para la imagen final.#
Las nubes de electrones para cada píxel pueden ser más grandes que en el caso de PMTs, tanto por el mayor QE como porque se puede dedicar más tiempo a detectar fotones (ya que esto se lleva a cabo para todos los píxeles simultáneamente). Sin embargo, falta el paso de amplificar el número de electrones de forma segura por encima del ruido de lectura antes de la cuantificación. En consecuencia, el ruido de lectura es potencialmente más problemático y, en algunos casos, incluso puede dominar el resultado.
Agrupación de píxeles (binning)#
Una forma de abordar el problema del ruido de lectura del CCD es utilizar agrupación de píxeles o binning. En este caso, los electrones de 4 (es decir, 2×2) píxeles del CCD se suman antes de ser cuantificados: las nubes de electrones son aproximadamente 4 veces más grandes en relación con el ruido de lectura (Figura 158), y la lectura puede ser más rápida porque es necesario cuantificar menos nubes de electrones. La desventaja obvia de esto es que no es posible devolver los electrones de los 4 píxeles a su lugar original. Como resultado, la medición agrupada simplemente se trata como un único píxel (más grande). La imagen grabada contiene el 25 % de los píxeles de la imagen sin agrupar, aunque sigue cubriendo el mismo campo de visión, por lo que se pierde información espacial. También se pueden utilizar contenedores más grandes, con un impacto correspondientemente más dramático en el tamaño de la imagen (Figura 158D).
Show code cell content
import numpy as np
def bin2x2(im):
"""
Apply 2x2 binning to the pixels of a 2D image.
Note that if the dimensions are not even numbers then the final row/column
of pixels may have to be trimmed.
"""
r = int(np.floor(im.shape[0]/2)*2)
c = int(np.floor(im.shape[1]/2)*2)
return im[0:r:2, 0:c:2] + im[1:r:2, 0:c:2] + im[0:r:2, 1:c:2] + im[1:r:2, 1:c:2]
# Simulate larger bins by progressively applying 2x2 binning
im = load_image('happy_cell.tif')
im = im.astype(np.float32)
# Add a little photon noise
rng = np.random.default_rng(1012)
im = rng.poisson(1 + im).astype(np.float32)
# Create binned images
im2 = bin2x2(im)
im4 = bin2x2(im2)
im8 = bin2x2(im4)
im16 = bin2x2(im8)
# Define a fixed read noise standard deviation & apply it
read_noise_sigma = 50
im += rng.normal(scale=read_noise_sigma, size=im.shape)
im2 += rng.normal(scale=read_noise_sigma, size=im2.shape)
im4 += rng.normal(scale=read_noise_sigma, size=im4.shape)
im8 += rng.normal(scale=read_noise_sigma, size=im8.shape)
# Show images with read noise added
fig = create_figure((8, 3))
show_image(im, clip_percentile=0.5, title='No binning', pos=(141))
show_image(im2, clip_percentile=0.5, title='2x2 binning', pos=(142))
show_image(im4, clip_percentile=0.5, title='4x4 binning', pos=(143))
show_image(im8, clip_percentile=0.5, title='8x8 binning', pos=(144))
glue_fig('fig_microscopes_ccd_binning', fig)
Figura 158 Ilustración del efecto de agrupamiento aplicado a una imagen que sufre de ruido de fotones y de lectura (grave). A medida que aumenta el tamaño del contenedor, los fotones de los píxeles vecinos se combinan en un solo píxel (más grande) antes de agregar el ruido de lectura. Como consecuencia, la imagen se vuelve más brillante en relación al ruido leído, pero a costa de información espacial.#
EMCCD: imágenes rápidas con bajos niveles de luz#
Por lo tanto, cabría preguntarse si es posible aumentar las nubes de electrones (como con el PMT) con un CCD y así obtener sus ventajas sin el mayor inconveniente del ruido de lectura. Los multiplicadores CCD de electrones (EMCCD) logran esto hasta cierto punto. Aquí, los electrones pasan primero a través de un «registro de ganancia» adicional antes de la cuantificación. En cada etapa de este registro de ganancia, cada electrón tiene una pequeña probabilidad -tal vez sólo el 1%- de ser amplificado (mediante «ionización por impacto») y dar lugar a dos electrones que ingresan a la siguiente etapa. A pesar de la pequeña probabilidad, al incorporar > 500 de estas etapas, el tamaño de la nube de electrones que surge incluso de un solo fotón puede amplificarse de manera segura por encima del ruido leído.
Sin embargo, la aleatoriedad del proceso de amplificación en sí introduce una nueva fuente de incertidumbre, por lo que se puede considerar que el resultado final tiene la misma precisión que si quizás sólo se detectaran alrededor de la mitad de fotones (ver Ruido para la relación entre el ruido y el número de fotones). Por lo tanto, el ruido de lectura se supera eficazmente a costa de más ruido de fotones.
Show code cell content
fig = create_figure(figsize=(8, 4))
show_image('images/ccd_conventional.png', title='CCD (no binning)', pos=131)
show_image('images/ccd_binned.png', title='CCD (2×2 binning)', pos=132)
show_image('images/ccd_em.png', title='EMCCD', pos=133)
glue_fig('fig_microscopes_ccd_types', fig)
Figura 159 Un diagrama simplificado que compara un CCD convencional (con y sin agrupamiento) y un EMCCD. Si bien cada uno tiene el mismo número físico de píxeles, cuando se utiliza el agrupamiento, los electrones de varios píxeles se combinan antes de la lectura, lo que hace que los píxeles «lógicos» de la imagen final sean más grandes. Para el EMCCD, los electrones se desplazan a través de un «registro de ganancia» antes de la cuantificación. Consulta Figura 157 para obtener etiquetas adicionales; el registro sensorial se ha omitido por simplicidad.#
Desde un punto de vista práctico, un EMCCD es como tener un CCD sin ruido de lectura, pero con la mitad de QE. ¿En qué circunstancias (es decir, números altos o bajos de fotones) es preferible un EMCCD a un CCD?
El registro de ganancia de los EMCCD ofrece beneficios principalmente cuando hay pocos fotones disponibles (es decir, cuando el ruido de lectura es el principal problema, como en SDCM). Los CCD son preferibles cuando hay muchos fotones disponibles (por ejemplo, en campo amplio).
Si eres escéptico acerca de esto, considera una imagen en la que la desviación estándar del ruido de lectura sea de 10 electrones y detectas en promedio 9 electrones (originalmente fotones). El ruido del fotón tiene entonces una desviación estándar de 3. El ruido de lectura es mucho mayor y dominará completamente la imagen: no se verá nada interesante. Entonces vale la pena gastar aún más ruido de fotones para poder eliminar el ruido de lectura. La imagen final seguirá teniendo un aspecto bastante malo, pero al menos interpretarla no es inútil.
Pero supongamos que en su lugar tienes 90000 fotones detectados, en cuyo caso la desviación estándar del ruido de los fotones ahora es 300. El ruido de lectura de 10 es comparativamente insignificante, y no hay nada que ganar con la multiplicación de electrones ni empeorando la situación del ruido de los fotones. .
Según las descripciones anteriores, ¿qué detectores parecen más apropiados (¡en general!) para (a) microscopía de campo amplio, (b) SDCM y (c) LSCM.
Las siguientes son reglas generales razonables:
Microscopía de campo amplio: Un CCD es adecuado debido a su capacidad para registrar muchos píxeles simultáneamente. La gran cantidad de fotones que normalmente se detectan significa que el ruido de lectura no suele ser un gran problema, y un EMCCD puede empeorar el problema del ruido en lugar de mejorarlo.
Microscopía confocal de disco giratorio: Se puede utilizar un CCD, pero a menudo es preferible un EMCCD (u otra variante de CCD). Esto se debe a que SDCM generalmente proporciona recuentos de fotones más bajos (ciertamente más bajos que en una imagen de campo amplio comparable), lo que puede significar que el ruido de lectura dominaría el resultado a menos que los fotones se amplifiquen de alguna manera.
Microscopía confocal de barrido láser: Los PMT son adecuados, ya que la imagen se construye un píxel a la vez.
Anteriormente exploramos cómo los CCD pueden utilizar la agrupación 2×2 para combinar los electrones correspondientes a varios píxeles en un solo píxel, que entonces es «menos ruidoso». Se puede lograr un efecto similar simplemente adquiriendo una imagen sin agrupar y aplicando un filtro de 2×2, en el que todos los coeficientes tienen valores de uno. Ambas técnicas dan como resultado imágenes que tienen aproximadamente cuatro veces más fotones contribuyendo a cada píxel y, por lo tanto, una mejor relación señal-ruido.
Piensa en una de las principales ventajas y desventajas de utilizar el filtrado después de la adquisición, en lugar de agrupar durante la adquisición.
Una imagen agrupada de 2 × 2 contiene 1/4 del número de píxeles de la imagen original. Esto representa una pérdida considerable de información espacial y obtendrías un resultado diferente si comenzaras a agrupar en la primera o segunda fila o columna, ya que se combinarían diferentes píxeles en cada caso. Por otro lado, el filtrado tiene la ventaja de darte una imagen que tiene exactamente el mismo tamaño que la original. Esto es como obtener las cuatro imágenes agrupadas posibles por el precio de una (es decir, las cuatro formas diferentes de dividir la imagen en bloques de 2×2 píxeles, en lugar de solo una manera), por lo que se pierde menos información espacial. Con el filtrado también tienes mucha más flexibilidad: puedes elegir un filtro de 3×3, un filtro Gaussiano o una variedad de opciones de filtrado diferentes para ver cuál es mejor. Con la agrupación, debes elegir una opción durante la adquisición y ceñirte a ella.
Sin embargo, si el ruido de lectura es un problema importante, entonces el filtrado podría no ser una buena opción. Esto se debe a que el ruido de lectura se agrega una vez a cada píxel adquirido, y no importa si tienes pocos fotones o muchos: su desviación estándar sigue siendo la misma. Por lo tanto, si los electrones de cuatro píxeles se combinan mediante agrupamiento durante la adquisición, entonces solo aparece una «unidad» de ruido de lectura en la imagen correspondiente a esos píxeles. Pero una imagen no agrupada habría agregado ruido de lectura cuatro veces, e incluso después del filtrado 2×2, esto sigue siendo más ruido de lectura que en una imagen agrupada comparable. A veces, este ruido adicional supone un costo demasiado alto para la flexibilidad del filtrado, y la agrupación es mejor. (A este respecto, recuerda que el ruido de lectura suele ser peor para las cámaras CCD, pero no es un problema para las EMCCD o PMT).